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口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测方法概介

日期:2018-10-29 16:04:10

口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)是由小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、烈性、高度接触性动物传染疫病,具有宿主范围广、传播快、危害巨大等特点,位居世界动物卫生组织(OIE)规定的A类动物疫病之首,我国也列为一类动物疫病,对畜牧业发展和公共食品安全危害巨大。目前绝大多数国家和地区仍然采取以灭活疫苗免疫为主的防控措施,所以有效抗原含量的高低直接决定口蹄疫疫苗的品质和免疫后特异性抗体水平的高低。

口蹄疫疫苗的生产环节必须严格遵守药品生产质量管理规范(GMP)标准对各个生产工艺环节实行全程追踪,包括细胞密度与活力、病毒的接种与收获、灭活、浓缩纯化、乳化与分装等,对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗抗原量的监督控制。目前,国外对于疫苗品质的评判主要是检测疫苗的PD50,鉴于我国对口蹄疫采取国家强制免疫的防控措施,每年检测口蹄疫疫苗PD50所需要的靶动物量较大,并且符合PD50检测需要的靶动物也比难购买,因此迫切需要建立一种能高效批量检测口蹄疫灭活疫苗生产中有效抗原含量的实验室检测技术,实时对疫苗生产各环节抗原含量进行有效监控,建立与疫苗效力检验PD50的相关性,切实为加快我国对口蹄疫的防控与净化保驾护航。目前,对于口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测的技术包括以下几种:

一、酶联免疫吸附技术(ELISA)

主要是采用双抗体夹心法进行检测,首先使用纯化的口蹄疫病毒抗原免疫BALB/C小鼠,取抗体效价到达要求的小鼠脾脏分离脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)经PEG-4000进行细胞融合,并利用有限稀释法进行3-5次亚克隆,筛选出阳性值高、分泌稳定且特异性强的杂交瘤细胞株扩大培养并及时冻存,大量制备腹水型单克隆抗体并进行纯化,利用抗体亚型鉴定试剂盒对收集的腹水型单抗进行亚型鉴定,利用间接免疫荧光技术(IFA)对制备的单克隆抗体进行验证,同时建立病毒抗原与腹水型单抗之间的线性关系。将制备的其中一株特异的单克隆抗体包被酶标板,另一株特异的单克隆抗体作为酶标抗体进行口蹄疫病毒抗原检测。该技术的优势主要是操作简便、特异型强、灵敏度高、可进行批量检测,便于在基层实际应用中推广,可以对不同血清型的口蹄疫病毒抗原含量进行检测。不足之处是前期对于单克隆杂交瘤细胞株的构建以及腹水型单抗的制备与纯化过程较复杂,易发生阳性克隆的丢失,制备的单克隆抗体只能检测部分抗原位点,主要是针对结构蛋白的部分位点,若完整病毒抗原发生降解时,使用该方法进行抗原检测会出现一定的误差。

二、蔗糖密度梯度超速离心法

口蹄疫病毒完整病毒粒子(146S)作为疫苗免疫时发挥作用的主要免疫原,在生产、储存, 运输等任何环节中的不同程度的降解都会引起动物机体免疫后效力下降。对于146S检测的原有方法是首先通过补体结合试验估算口蹄疫病毒总抗原量(包括146S和12S),然后用氟化碳(CF4)去除其中的12S抗原,从而可以间接估算出口蹄疫病毒146S的含量。20世纪90年代,国外一些学者建立了蔗糖密度梯度超速离心法对口蹄疫病毒146S进行分离纯化,同时利用紫外分光光度计在259nm处检测吸收峰,并利用自动化电脑软件系统对吸收峰面积进行计算,从而得出口蹄疫病毒 146S含量,目前,该方法仍然是各大口蹄疫灭活疫苗生产企业对各生产环节中146S含量检测的主要技术,该方法也可用于成品苗中口蹄疫病毒 146S抗原含量的测定。也可通过氯化铯密度梯度离心法进行定量分析来测定口蹄疫病毒146S抗原量,在ug/ml水平估测146S抗原量,并用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测口蹄疫病毒抗原多肽的完整性,并分析其质量。中农威特公司董金杰等研发人员建立的口蹄疫病毒 146S含量蔗糖梯度离心法对公司口蹄疫疫苗生产环节的质量把控提供了有力保证,同时被编入行业标准,得到各大疫苗生产企业的高度认可和广泛应用。

三、乳仓鼠肾细胞(BHK-21)培养法

利用实验室传代培养的处于生长对数期的BHK-21传代细胞接种不同稀释度的口蹄疫病毒,通过在显微镜下观察不同稀释度的口蹄疫病毒感染BHK-21细胞时所产生的细胞病变(CPE)来估算病毒含量,但该方法用时较长,细胞状态、人为操作因素对结果影响较大。

四、病毒蚀斑数测定法

目前,有报道称,国外有研究机构和疫苗生产企业采用病毒蚀斑数测定法进行口蹄疫病毒抗原定量。具体操作步骤为:使用BHK-21或IBRS-2细胞,按常规操作规程来培养细胞,然后弃去原培养液,用灭菌1xPBS轻轻润洗细胞3-4次,病毒进行梯度稀释后接种至细胞培养板,在37℃,5%CO2培养箱里吸收1h后,加入一定量的维持液,继续静置培养72h,弃尽原培养液,用一定体积的固定液进行固定,之后染色30min,自来水冲洗残留染色液,自然风干后进行病毒蚀斑的计数并计算病毒滴度。口蹄疫病毒感染细胞时,首先感染它周边的细胞,最终可形成一个个肉眼清晰可见的病毒感染斑,对病毒蚀斑进行记数,按照已有的公式来计算病毒滴度。该技术可操作性强,结果判定简单,计算数据较准确,但是,该技术对抗原性的变化不能进行检测。

五、实验动物替代法

目前,关于该方法的文献报道,主要集中在利用乳鼠替代本动物进行疫苗效力检验,计算病毒的LD50,操作方法包括:在三级生物安全防护实验室将口蹄疫病毒不同梯度稀释后接种乳鼠,规定时间内统计小鼠死亡数,根据特有的公式计算病毒的LD50。该方法的优点是成本低,实验动物易获得,缺点是耗时长,一般为5d左右,由于动物样本间的差异,使得误差较大。

六、分子排组色谱法

中国兽医药品监察所徐嫄等人建立了一种新的方法来测定口蹄疫病毒 146S含量。具体操作是在口蹄疫疫苗生产过程中通过分子排阻色谱技术来分离病毒培养液中的各组分,根据各组分分子量按先大后小被洗脱,利用连续紫外分光光度计在紫外波长259nm下检测吸收值,通过标准品建立的线性回归方程公式计算疫苗中146S含量。分子排阻色谱法检测范围可达到为 6~75ug/ml,该检测方法对不同谱系的口蹄疫病毒均通用,并且与现主要的蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度离心法有较好的相关性。该技术由于使用商品化的凝胶层析介质,可以对整个检测过程实现自动化、各环节可控化、批次间标准化,尽可能减少人为操作造成的检测误差。这种方法使用标准的层析介质,可以实现自动化操作。但是该检测技术目前也存在着缺点,目前,国内市场化的口蹄疫疫苗基本为O/A二价灭活疫苗,该方法只能测定疫苗中总的146S含量,而不能对O、A两种组分分别进行检测,且该技术具有146S最低含量检测限高、灵敏度低等特点,对146S含量较低的疫苗不能准确检测,仍需进一步的完善。

七、其他

用于口蹄疫疫苗146S含量定量的其它方法包括:反向被动血凝试验、琼脂糖扩散试验、实时荧光PCR等方法,但现有的各种检测方法都存在着一定的局限性。相信随着分子生物学和蛋白质学等相关学科的飞快进步,针对口蹄疫病毒 146S含量检测技术也会不断完善,新的检测方法也必将会替代现行的本动物攻毒保护试验,降低企业生产成本,切实提高生物安全。


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